各種動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書
200ml
室溫避光儲(chǔ)存，有效期少2 年。
本分離液為Ficoll、羥yi基淀粉550與泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝外周血可在分離液中分層。離心時(shí)，
在Ficoll、羥yi基淀粉的作用下紅細(xì)胞與粒細(xì)胞聚集并迅速沉降；此時(shí)，淋巴細(xì)胞及其他單個(gè)核細(xì)胞仍處于
分離液上層，紅細(xì)胞污染可忽略不計(jì)。大部分血小板可在細(xì)胞清洗低速離心過程中去除。 其他人及動(dòng)物多
種比重細(xì)胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時(shí)應(yīng)
提供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。
適用于從動(dòng)物抗凝血液中分離淋巴細(xì)胞，無菌條件下所分離的淋巴細(xì)胞可用于細(xì)胞培養(yǎng)等。本品僅供
科研使用。
A．本實(shí)驗(yàn)要求，在正常大氣壓下，分離液、分離樣本以及分離環(huán)境溫度為20℃±2℃。分離液在低溫時(shí)呈較
高密度，在高溫時(shí)呈較低密度。細(xì)胞分離液從冰箱取出后，不可立即使用，操作前可將樣本和分離液復(fù)溫
18-22℃。為獲得佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，好在取血后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液提取后存放時(shí)間越長細(xì)胞活性
越低。
B．實(shí)驗(yàn)過程中，如需稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血
細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。
C．優(yōu)抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會(huì)影響細(xì)胞活性。應(yīng)注意在血液稀
釋過程中去除抗凝劑體積。
D．實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過高的液體，手套中的粉末顆粒及高內(nèi)毒素會(huì)激
活淋巴細(xì)胞從而降低細(xì)胞得率及活性。
E．本實(shí)驗(yàn)不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁影響分離效
果。推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。
F．吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
G．如需進(jìn)行B、T細(xì)胞計(jì)數(shù)，則需血液貯藏時(shí)間不得多于10小時(shí)，否則將導(dǎo)致細(xì)胞被激活，得率降低。
H．為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上4-20%蔗糖梯度等滲溶液進(jìn)行二次離心。
I．細(xì)胞純度可在步驟10后使用瑞氏染色方法確定，細(xì)胞活性可用臺(tái)盼藍(lán)處理后觀察。
J．由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)
節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索佳的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。
一、當(dāng)血液樣本小于3ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支15ml離心管，加入3ml分離液置于18-22℃復(fù)溫。
2. 將血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g離心20分鐘。低溫（如4℃）離心會(huì)降低細(xì)胞
得率。
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3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞層）0.5cm以上的上清液部分，棄去。
4. 用吸管小心吸取分離液層及淋巴細(xì)胞層于另一新離心管內(nèi)。
5. 在步驟4中所得離心管中加入10ml PBS緩沖液或HBSS緩沖液混勻。
6. 250g離心10分鐘。
7. 棄上清。
8. 用吸管以5ml PBS緩沖液或HBSS緩沖液重懸所得細(xì)胞。
9. 250g離心10分鐘。
10. 棄上清。重復(fù)步驟7、8、9，后以0.5ml后續(xù)試驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、當(dāng)血液樣本大于3ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 當(dāng)血液樣本粘度過高或血液樣本大于等于3ml時(shí)，優(yōu)稀釋方法：將血液于18-22℃以250g離心10分
鐘，棄去血漿，補(bǔ)充添加生理鹽水，添加量為所棄去血漿體積的1.5-2倍，混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒?br>會(huì)降低細(xì)胞得率及活性。
2. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，加入分離液（加入量與稀釋后的血液樣本體積相等），置于18-22℃復(fù)溫。
3. 將經(jīng)稀釋處理的血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g離心20分鐘。低溫（如4℃）離
心會(huì)降低細(xì)胞得率。注：加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二。
4. 剩余步驟同“情況一"中步驟3步驟10。
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下
本分離液是敏光型的，應(yīng)在18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，溶液變渾濁或污染
細(xì)菌時(shí)，產(chǎn)品失效。保存溫度較低（10℃以下）時(shí)分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
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